大局菌群主要存在于水及動(dòng)物的腸道，是食品及水受糞便污染的主要細(xì)菌衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，因此大腸菌群檢測(cè)是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)。大腸菌群是一群能在37'C環(huán)境下24h發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，主要包括四屬:大腸埃希民菌屬、拘橡酸桿菌屬、克雷伯民菌屬、腸桿菌屬。食品衛(wèi)生法規(guī)定:食品中不允許含有傷寒、副傷寒、沙門(mén)氏、躪疾、霍亂等消化系統(tǒng)病源菌，但這些致病菌卻實(shí)際上不可能在各個(gè)場(chǎng)合中檢測(cè)出來(lái)。從同源角度看，把容易檢出的大腸菌群從食品中檢出便意味著該食品受人畜糞便污染。因該菌主要來(lái)源于人畜糞便，所以，對(duì)大腸菌群的測(cè)定常常被作為受糞便污染程度的唯→指標(biāo)，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。有些血清型大腸菌經(jīng)口傳染人煬道后會(huì)引起嬰兒腹礙。大腸菌侵入人體其它部位還會(huì)引起尿道炎、膀脫炎，有時(shí)引起輸卵管炎、腎孟腎炎、膽道炎、子宮炎，并能引起產(chǎn)后敗血癥及新生兒敗血癥等。大腸菌群還是小兒消化不良癥、胃腸障礙的→個(gè)病源學(xué)因素。我國(guó)現(xiàn)行檢測(cè)大腸菌群的方法有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB4789.3-1994(三步多管發(fā)酵法)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN0168-1992。國(guó)標(biāo)法的檢驗(yàn)程序較復(fù)雜，需經(jīng)過(guò)初發(fā)酵試驗(yàn)→確定試驗(yàn)→終結(jié)試驗(yàn)(復(fù)發(fā)酵試驗(yàn))。一般需3-4d，不適于衛(wèi)生監(jiān)測(cè)。如果不能及時(shí)監(jiān)測(cè)食品衛(wèi)生，常常使腸道傳染病在夏秋季直線(xiàn)上升。為了積極預(yù)防腸道傳染病，保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益和身體健康，為了改變目前檢驗(yàn)不能適應(yīng)生產(chǎn)和消費(fèi)的狀況，許多學(xué)者研究了快速檢驗(yàn)大腸菌群方法，如快速酶法、濾膜法、紙片法、平板法等。本文就國(guó)內(nèi)外的一些快速檢驗(yàn)大腸菌群方法的研究現(xiàn)狀做一綜述。
1快速酶法
1978年Warren率先研究檢測(cè)半乳糖苦酶(β-GA-LA)，作為快速檢測(cè)大腸菌群的手段，而后Mobery1985)，Berg(1988)，edberrg(1990)都研究了酶檢測(cè)技術(shù)。美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)(1989)編《水與廢水檢查標(biāo)準(zhǔn)方法》一書(shū)中，規(guī)定β-GALA和氧化酶(oxidase)的檢測(cè)為快速確定(24h)大腸菌群的方法。其原理是使用人工合成的半乳糖與色基的結(jié)合物作為β-半乳糖背酶底物，當(dāng)?shù)孜锉患?xì)菌產(chǎn)生的酶水解后色基游離，顯色或發(fā)熒光，證明有大腸菌群的存在。(細(xì)菌分解乳糖需要兩種酶:一是半乳糖背滲透酶，另一種是β-半乳糖昔滲透酶，它存在于菌體中，它可將進(jìn)入菌體細(xì)胞的乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。)目前，常用底物有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、3、4-環(huán)己酮-β-D-半乳糖苷、8-羚基喳琳-β-D-半乳糖昔等。
1.1 4-甲基傘型酮-β-D-半乳糖背(4-MU-β-D-galactoside)為底物的快速酶法底物被細(xì)菌分解為4-甲基傘型酮和糖苷，其中4-甲基傘型酮是熒光物質(zhì)。從國(guó)標(biāo)法初發(fā)酵管中，吸取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的菌液，滴于濾紙上進(jìn)行β-半乳糖背酶及氧化酶檢測(cè)。若試驗(yàn)的濾紙?jiān)陂L(zhǎng)波段紫外線(xiàn)燈下發(fā)綠熒光，而氧化酶試驗(yàn)為陰性的革蘭氏陰性桿菌，則確定該初發(fā)酵管存在大腸桿菌，無(wú)須再作平板分離與復(fù)發(fā)酵。
1.2茜素-β-D-半乳糖苷酶(Aliz-gal)為底物的快速酶法 2000年James等報(bào)道了一種新的檢測(cè)大腸菌群的酶底物:茜素-β-D-半乳糖苷酶(Aliz-gal)。該試劑具有較其它試劑更靈敏的性能，可提高檢測(cè)的靈敏度。茜素-β-D-半乳糖背酶(Al泣-gal)的合成:將茜素懸浮于丙酮和氫氧化仰的混合液內(nèi)，加入漠代乙酷半乳糖的丙酮溶液，攪拌lOh。減壓蒸館除去丙酮，將產(chǎn)物過(guò)濾、水洗、干燥，溶于二氯甲燒，用氧化鋁吸除游離茜素，過(guò)濾，蒸發(fā)除去二氯甲烷，在乙醇中重結(jié)晶，得茜素乙酸半乳糖，再于甲醇?jí)A溶液中脫酷而得。茜素-β-D-半乳糖苷酶(Aliz-gal)培養(yǎng)基的制備:茜素-β-D-半乳糖昔酶(Aliz-gal)50mg，蛋白腺20g，無(wú)水磷酸氫二餌2.75g，氧化納掠，月桂基硫酸納O.lg，異丙基硫代半乳糖背0.03g，硫酸鋁餌(或擰橡酸鐵鍍)O.5g，擰橡酸鐵鍍O.1g，瓊脂15g，蒸館水100Oml。調(diào)pH值至7.4，116°C高壓滅菌lOmin。研究結(jié)果表明，茜素-β-D-半乳糖苦酶(A1iz-gal)是檢測(cè)食品中大腸菌群的一個(gè)很好的試劑，它具有高度的敏感性和準(zhǔn)確性，可在18-24h內(nèi)顯示出半乳糖酶反應(yīng)，達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定大腸菌群的目的。在同類(lèi)性質(zhì)的酶底物中，茜素-β-D-半乳糖昔酶(Aliz-gal)的用量較低，可以和不同的陽(yáng)離子(Fe、AI)形成帶色的混合物，這樣就便于和其他的顯色劑合用，組成具有多種性能的鑒別培養(yǎng)基。與同類(lèi)培養(yǎng)基相比，茜素-β-D-半乳糖昔酶(Aliz-gal)可做傾注培養(yǎng)，在瓊脂深層菌落特征仍很明顯，而其他同類(lèi)培養(yǎng)基只能做涂布培養(yǎng)。總之，試驗(yàn)證明用茜素-β-D-半乳糖苷酶(Aliz-gal)底物檢測(cè)食品中的大腸菌群，具有特異性強(qiáng)、速度快、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，且穩(wěn)定性較高，可作為標(biāo)準(zhǔn)方法加以應(yīng)用。
1.3大腸菌群產(chǎn)色基質(zhì)試驗(yàn) 大腸菌群產(chǎn)色基質(zhì)試驗(yàn)，也稱(chēng)為Autoanlysiscolilert(AC)法。此法1992年已被美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)方法委員會(huì)在18版《水與廢水檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法》中選用。(1)AC法原理:將一種可被微生物水解的基質(zhì)作為待測(cè)微生物的特殊基質(zhì)，這種基質(zhì)也稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)物，它具有指示劑和營(yíng)養(yǎng)物的雙重作用，在微生物作用下產(chǎn)生顏色變化或進(jìn)一步發(fā)生熒光，通過(guò)肉眼觀察或再配一個(gè)手持式長(zhǎng)波紫外線(xiàn)燈(波長(zhǎng)為366nm)即可獲得結(jié)果。產(chǎn)色基質(zhì)如鄰-硝基苯-β-D-毗喃半乳糖苷(ONPG)被用于檢測(cè)由總大腸菌群細(xì)菌產(chǎn)生的β-D-半乳糖苦酶，該酶水解基質(zhì)使產(chǎn)生一種顏色變化，在24-28h內(nèi)不需增加其它的手續(xù)即可指示和證實(shí)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。產(chǎn)色基質(zhì)4-甲基傘型基-β-D-葡糖苷酸(MUG)被用于檢測(cè)大腸埃希氏菌(大腸桿菌，Escherichiacoli)。(2)AC法培養(yǎng)基配方。粉末狀配方含有如下無(wú)水化合物(制備每升基質(zhì)):(NH4)2S04 5.00g，MnS04O.0005g，ZNso4 O. 0005g， MgS04 O. 10g， Nacl10. 0g， CaCl2 O. 05g， Na2S03 O. 04g，AmpHotericin B O.OOlg，ONPG(鄰-硝基苯-β-D-口比喃半乳糖昔) O. 50g，MUG( 4-甲基傘型基-β-D-毗喃葡糖背酸) O. 075g，Solanium o. 50g， N~m咱46. 2g， KH2P04 O. 9g，鈾 鹽5. 3g，N -2 - hy由oxyethylpiperazine - N - 2 - ethane sul-fonic acid 6. 9g。以上培養(yǎng)基中Solanium為一種專(zhuān)利商品， 含有起乳化劑作用的植物提取物，并含有某些抗生素。為確保良好的試劑質(zhì)量和結(jié)果的一致性，需要使用配置好的商品基質(zhì)試劑。
