摘要：研究了5mg/mL黑魚魚皮膠原溶液的流變和熱穩定性，并與相同濃度牛皮膠原溶液作比較;考察了溫度對黑魚膠原的動態粘彈性與成纖維過程的影響;對比分析了戊二醛和己二酸-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯用于交聯改性黑魚膠原溶液的效果。結果表明，相同濃度的黑魚膠原與牛皮膠原溶液的流變學參數和熱穩定性存在顯著差別，黑魚膠原的分子纏結程度較低、結構穩定性較差;黑魚膠原的動態粘彈性與成纖維行為都具有明顯的溫度依賴性;己二酸NHS酯對黑魚膠原溶液具有較好的交聯改性效果，有望取代戊二醛用于提升魚膠原基材料的結構性能。
關鍵詞：魚膠原;流變性能;熱穩定性;化學交聯
膠原是構成細胞外基質的重要組分，是動物結締組織的主要纖維蛋白，因其優良的生物相容性、生物降解性、低抗原性等性質，被廣泛用于化妝品、制藥、食品、醫學等領域[1-3]。
目前，商品化膠原主要取材于牛、豬等陸生哺乳動物的皮、腱、骨等結締組織，但由于瘋牛病、口蹄疫等人畜共患病在世界范圍內的頻繁爆發，導致哺乳動物膠原及其制品存在較大的生物安全風險[4-6]。因此，尋求能夠完全或部分替代哺乳動物膠原的新型膠原材料是近年來的研究熱點[7-9]。相對而言，從魚加工廢棄物中提取的魚膠原具有生物安全性好、原料來源豐富且成本低廉等優勢，因而當前圍繞魚膠原的制備、改性及應用的研究方興未艾[10-12]。I型膠原是動物皮(牛皮、魚皮等)中含量最多的膠原類型[1]。
不論是牛皮還是魚皮，從中提取的I型膠原分子都具有由3條多肽鏈相互纏繞而成的三股螺旋結構，其分子長度約為300nm，相對分子質量約為30萬[1，10，13]。然而，膠原的氨基酸組成、熱穩定性等性質與動物的種屬及生存環境密切相關。一般而言，陸生哺乳動物膠原比魚膠原的熱穩定性更好，這主要是由于前者的亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)含量更高，而亞氨基酸對于氫鍵的形成及三股螺旋結構的穩定都至關重要[13，14]。因此，基于魚膠原和牛皮膠原結構與性能的異同，目前已有大量關于不同來源魚膠原的研究報道，但其相關信息仍然不足以支撐魚膠原的規模化開發利用。
其一，魚膠原在制備與應用過程中通常會涉及膠原溶液的加工處理(如萃取、膠凝、紡絲和成膜)，故充分了解膠原溶液的流變性能非常重要[15-17]，然而鮮見有關魚膠原溶液的流變學研究。例如，Zhang等[18]測試了較高濃度(10~20mg/mL)大鰭鳠魚皮膠原溶液的流變性能，但也有必要了解較低濃度的魚膠原溶液(如膠原提取液)的流變行為及其與牛皮膠原溶液的差異。
其二，魚膠原作為一類蛋白質材料，理解其熱穩定性及與哺乳動物膠原的區別對其實際應用具有重要意義[19-22]，但膠原的熱穩定性測試高度依賴于樣品狀態和實驗條件[10，14]，甚至于針對同一來源魚膠原的不同文獻報道的膠原變性溫度數值存在差異，從而缺乏在相同條件下對各種膠原材料熱穩定性的比較研究。
其三，與哺乳動物膠原相比，魚膠原較差的熱穩定性與機械力學性能限制了其實際應用[11]，進而需要通過交聯或共混策略強化材料的綜合性能，但關于魚膠原的改性研究較為少見。例如，已有報道采用“零長度”的碳化二亞胺交聯劑增強鮭魚膠原的熱穩定性[11]，然而關于交聯劑分子長度對魚膠原改性效果的影響尚不清楚。
本文對比研究了相同濃度(5mg/mL)的黑魚膠原與牛皮膠原溶液的流變和熱穩定性，并考察了溫度對黑魚膠原的動態粘彈性以及成纖維性能的影響，最后分析比較了兩種交聯劑(己二酸-N-羥基 琥珀酰亞胺酯、戊二醛)對黑魚膠原溶液的交聯改性效果，為黑魚膠原的高值轉化利用提供理論和技術參考。
1實驗部分
1.1主要材料與儀器
1.1.1主要材料
黑魚魚皮和牛皮I型膠原海綿均為實驗室自制，分別參照文獻方法制備[8，16];冰醋酸、己二酸、戊二醛、丙酮、二甲亞砜(DMSO)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠;高分子量標準蛋白為電泳級，購自美國BIO-RAD公司;N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)均為分析純，購自上海共價化學科技有限公司;去離子水(自制);其它化學試劑為國產分析純。
1.1.2主要儀器
3700高速冷凍離心機，日本KUBOTA公司;FD-1冷凍真空干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司;DZF-300真空干燥箱，鄭州長城科工貿有限公司;pHS-3C型pH計，上海精密科學儀器有限公司;Mini-PROTEAN3CellAssembly電泳儀，美國Bio-Rad公司;Gemini200動態流變儀，英國Malven公司;Lambda25紫外可見分光光度計，美國PERKIN-ELMER公司;NicoletiS10傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀，美國ThermoScientific公司;DSC200PC差示掃描量熱儀，德國NETZSCH公司;Agilent400-MRDD2核磁共振波譜儀，美國AgilentTechnologies公司。
1.2實驗方法
1.2.1膠原溶液的流變測試
動態頻率掃描：用0.1mol/L醋酸分別配制相同濃度(5mg/mL)的黑魚魚皮膠原和牛皮膠原溶液，在18℃下用動態流變儀檢測彈性模量G'、粘性模量G''、損耗角正切Tan啄(G''/G')和復數粘度濁*隨掃描頻率的變化情況;采用錐形板夾具(錐角4毅、直徑40mm)，應變5%，掃描頻率為0.01~10Hz。溫度對膠原溶液動態粘彈性的影響：用上述動態流變儀對5mg/mL黑魚膠原溶液進行線性升溫并掃描收集流變數據;固定頻率1Hz，應變5%，升溫速率0.5℃/min，掃描溫度區間18~40℃。
1.2.2差示掃描量熱(DSC)分析
分別以相同濃度(5mg/mL)的黑魚膠原和牛皮膠原溶液為測試對象，考察膠原熱變性DSC曲線隨升溫速率的變化規律。樣品參比為0.1mol/L醋酸，氮氣保護60mL/min，升溫速率采用2、5和8℃/min，溫度區間4~60℃。
1.2.3熱動力學分析
采用熱動力學分析手段(基于多重升溫速率的等轉化率法：Friedman法和OFW法)[21，22]，分別對1.2.2獲得的兩種膠原的DSC曲線進行動力學分析，對比考察不同膠原熱變性活化能隨轉化率的變化規律。
1.2.4膠原成纖維濁度曲線測定
用0.01mol/L醋酸配制5mg/mL黑魚膠原溶液，將其用含氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進行稀釋，最終所得膠原溶液的各項參數分別為：膠原濃度1mg/mL、磷酸鹽濃度10mmol/L、氯化鈉濃度80mmol/L、pH值7.1。采用紫外可見分光光度計檢測樣品吸光度變化得到膠原成纖維濁度曲線，掃描波長為313nm。根據濁度曲線分別計算達到最大吸光度值一半所需時間(1/2)和達到平衡時吸光度的變化值(h)，對比考察溫度28、29、30、31和32℃對黑魚膠原成纖維動力學的影響。
1.2.5己二酸NHS酯的合成與表征
在文獻報道合成方法[23]的基礎上進行了調整：先用丙酮將己二酸和NHS溶解，然后向混合溶液中加入EDC·HCl，在常溫下攪拌反應24h后，減壓旋轉蒸發除去溶劑，采用結晶、真空干燥等方法對合成產物進行純化，得到己二酸NHS酯。用核磁共振(NMR)對樣品結構進行1HNMR表征;采用FTIR驗證酯基官能團，掃描波數450~4000cm-1，分辨率為2cm-1。
1.2.6黑魚膠原溶液的交聯改性
酸性條件下的交聯改性：用0.1mol/L醋酸配制5mg/mL黑魚膠原溶液，用DMSO配制0.125mol/L己二酸NHS酯溶液，將其逐滴加入黑魚膠原溶液中，使得NHS酯活性基團與膠原氨基的摩爾比為1，在18℃下分別反應24h和72h后，用甘氨酸中止反應并對0.1mol/L醋酸進行透析，分別得到NHS酯改性黑魚膠原SSC(a-N1)和SSC(a-N1×3);按照類似方法，采用0.125mol/L戊二醛水溶液，制備得到戊二醛改性黑魚膠原SSC(a-G1)和SSC(a-G1×3)。
堿性條件下的交聯改性：將0.125mol/L己二酸NHS酯溶液分別逐滴加入四份5mg/mL黑魚膠原溶液中，使得NHS酯活性基團與膠原氨基的摩爾比分別為1/6、1/2、1和1，快速攪拌均勻，再用NaOH調pH約為10，在18℃下分別反應24、24、24和72h后，用甘氨酸中止反應，再用0.1mol/L醋酸透析，分別得到NHS酯改性黑魚膠原SSC(b-N1/6)、SSC(b-N1/2)、SSC(b-N1)和SSC(b-N1×3);按照類似方法，分別制備得到戊二醛改性魚膠原樣品SSC(b-G1/6)、SSC(b-G1/2)、SSC(b-G1)和SSC(b-G1×3)。
1.2.7交聯改性黑魚膠原的表征
電泳測定：參照文獻報道方法[12]，將1.2.6所述12種改性魚膠原樣品分別與電泳樣品處理液混合，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)手段考察不同的化學交聯改性條件對黑魚膠原結構的影響，以未改性膠原樣品作為對照。熱分析：采用DSC對比考察改性前后黑魚膠原樣品的熱變性情況，升溫速率5℃/min，掃描溫度區間4~70℃。
2結果與討論
2.1黑魚膠原溶液的動態流變性能
流變測試能夠獲得高分子材料在應力/應變條件下的動態粘彈性信息。展示了相同濃度的黑魚膠原和牛皮膠原溶液的動態粘彈性參數(G'、G''、Tan啄和濁*)隨頻率的變化規律。兩種膠原溶液的彈性模量和粘性模量都隨著掃描頻率的增加而升高，而且在相同頻率下(個別高頻區除外)黑魚膠原溶液的粘彈性模量均低于牛皮膠原溶液的相應模量。
此外，牛皮膠原和黑魚膠原溶液由粘性流動轉變為彈性流動的交叉點頻率分別為0.88Hz和1.51Hz。在交叉點頻率以下，兩種膠原溶液的G'G'')。交叉點頻率與分子鏈段的松弛特性有關，頻率越大表明松弛越快，可見黑魚膠原比牛皮膠原分子的鏈段松弛更快。相對而言，兩種膠原溶液的損耗角正切都隨著頻率的增加而降低，且黑魚膠原溶液的Tan啄均大于相同頻率(當頻率低于4Hz)下牛皮膠原溶液的Tan啄。
當頻率低于0.8Hz時，Tan啄都大于1，表明此時兩種膠原溶液都是粘性特征占主導地位，然而牛皮膠原比黑魚膠原的Tan啄小，這可能是由于牛皮膠原分子鏈段纏結程度更高[16]，鏈段運動時的內摩擦力更大，從而使鏈段運動受阻，表現為彈性特征相對略強。另外，兩種膠原溶液的復數粘度也都隨著頻率增加而降低，呈現剪切變稀流變行為，且在相同頻率下黑魚膠原比牛皮膠原溶液的濁*更小，說明黑魚膠原比牛皮膠原分子纏結程度更低。流變和熱穩定性是魚膠原區別于哺乳動物膠原的兩大顯著特征[1]。
在上述動態頻率掃描的基礎上，進一步考察了溫度對黑魚膠原溶液動態粘彈性的影響當溫度低于26℃時，隨著溫度的上升，G''和濁*逐漸下降而G'和Tan啄變化不大;當溫度介于26~32℃，G''和濁*都快速下降，同時Tan啄出現最大峰值，這是由于溫度誘導膠原構象發生轉變，即從天然的三股螺旋結構變性為無規卷曲構象[16-18]。通常把升溫流變測試時Tan啄的峰值對應的溫度稱為膠原的動態變性溫度(Tdd)，牛皮膠原、大鰭鳠膠原和黑魚膠原的Tdd分別為32.6℃[16]、29.5℃[18]和29.2℃，表明黑魚膠原的動態流變穩定性與大鰭鳠膠原相當，但二者都低于牛皮膠原。
2.2黑魚膠原溶液的熱穩定性分析
本文從以下3個方面研究考察了黑魚膠原溶液的熱穩定性：1)比較相同濃度黑魚膠原和牛皮膠原溶液在多個升溫速率下的DSC曲線;2)基于等轉化率法動力學分析，從活化能角度對比兩種膠原溶液的熱行為;3)考察不同溫度對黑魚膠原成纖維過程的影響。兩種膠原溶液的DSC吸熱峰都隨著升溫速率的增加而向高溫方向移動，說明二 者的熱變性都是動力學控制過程[21，22]。
在相同升溫速率下，黑魚膠原的熱變性DSC峰值溫度明顯低于牛皮膠原的相應數值，分別為2℃/min：31.1℃和39.3℃;5℃/min：32.3℃和40.4℃;8℃/min：32.9℃和40.9℃，說明黑魚膠原的熱穩定性相對牛皮膠原較弱。為了進一步挖掘其中DSC曲線的熱動力學信息，采用等轉化率法(Friedman法和OFW法)考察了膠原熱變性活化能隨轉化率的變化規律。
盡管兩種等轉化率法對于同一膠原樣品的分析結果存在一定差異，但黑魚膠原和牛皮膠原的熱變性活化能隨轉化率的增加都是整體呈下降趨勢，且近似于先凹后凸，這說明兩種膠原的熱變性過程都為多步復雜反應[21,22]。特別需要強調的是，在熱變性的初始階段(轉化率小于0.5)，相同轉化率下黑魚膠原的熱變性活化能低于牛皮膠原的活化能，表明黑魚膠原的熱穩定性略差。膠原在模擬生理條件下的自組裝成纖維性質對于其高值應用十分重要[1]。
隨著溫度的升高，黑魚膠原成纖維的速度加快(1/2逐漸下降)，同時成纖維濁度的最大值呈現出先增加后降低的趨勢(△在30℃時達到峰值)，這是由于膠原成纖維的主要驅動力是疏水作用，而升溫有利于增強疏水作用[24]，從而促使膠原成纖維進行，但當溫度臨近膠原的熱變性溫度時，膠原分子結構遭受破壞，進而阻礙了自組裝膠原纖維的形成。可見，30℃是適于黑魚膠原成纖維的較優溫度條件，但該溫度明顯低于人體的正常生理溫度。若想將黑魚膠原在人體內進行原位自組裝成纖維的應用，有必要通過改性手段提高其在生理環境下的結構穩定性。
2.3黑魚膠原溶液的化學交聯改性
綜合2.1和2.2所述可知，黑魚膠原的結構穩定性比牛皮膠原差，在一定程度上限制了黑魚膠原的應用，因而有必要通過化學交聯等手段改性提升膠原材料的穩定性[10，11]。據報道，交聯劑的分子長度對于有效穩固膠原三股螺旋結構非常關鍵[25]，因而本文對比考察了兩種分子碳鏈長度相當的交聯劑對黑魚膠原的改性效果：1)戊二醛，傳統的膠原交聯劑，反應活性高，但生物相容性較差[1,26];2)己二酸NHS酯，近年來新興的蛋白偶聯劑，反應活性和生物相容性都較好[1,14]。
3結論
相同濃度的黑魚膠原與牛皮膠原溶液的流變行為和熱穩定性存在較大差別，黑魚膠原的分子纏結程度更低、結構穩定性更差。在確保膠原不變性的前提下，通過改變溫度能夠有效調節黑魚膠原的動態粘彈性與成纖維性能。盡管己二酸NHS酯的反應活性比戊二醛弱，但其更好的生物相容性以及足夠高的交聯改性程度，使其有望用于提升膠原材料的綜合性能，以此推動魚膠原基生物材料的產業化應用。
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作者：劉文濤1，2*，白聰1，3，沈里瑞1
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