摘要： 目的 探討煙草中主要毒性成分尼古丁(NIC)是否加重他克莫司(TAC)誘導(dǎo)的腎臟損傷。方法 將32只雄性SD大鼠分為正常對(duì)照組(VH)組、TAC組、NIC組、NIC+TAC組，每組8只。各組分別給予橄欖油、TAC、NIC、NIC+TAC干預(yù)4 w。檢測(cè)各組生化、腎功能、尿蛋白排泄量、腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)程度，免疫組化和Western印跡法分別檢測(cè)致纖因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果 與TAC組比較，NIC+TAC組血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿蛋白排泄量顯著升高，腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)程度、腎小球系膜區(qū)面積顯著擴(kuò)大，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1表達(dá)顯著增加；血清及尿排泄8-羥脫氧鳥苷(8-OHdG)顯著增加，超氧化物歧化酶(SOD)1、SOD2表達(dá)顯著降低，NADPH氧化酶(NOX)-2、NOX-4表達(dá)顯著增加；B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2/Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)比值顯著降低，活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3顯著增加，原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法顯示TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(均P<0.05)。結(jié)論 NIC加重了TAC誘導(dǎo)的腎損傷，其機(jī)制可能與NIC加重氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)，暗示戒煙可能對(duì)服用TAC的移植吸煙者有益。
關(guān)鍵詞 : 尼古丁;他克莫司;氧化應(yīng)激;細(xì)胞凋亡;
Abstract： Objective To investigate whether nicotine(NIC), a major toxic component of cigarette smoking, exacerbates tacrolimus(TAC)-induced renal injury. Methods Sprague-Dawley rats were treated daily with NIC, TAC, or both drugs for 4 weeks. The influence of NIC on TAC-caused renal injury was examined via renal function, histopathology, expression of fibrotic mediators, oxidative stress, and apoptosis related gene.Results Both NIC and TAC significantly impaired renal function and histopathology, while combined NIC and TAC treatment aggravated these parameters beyond the effects of either alone. Oxidative stress was increased, the expression of fibrotic mediators and apoptosis related gene from either NIC or TAC were also exacerbated by the two combined.Conclusions NIC could exacerbate chronic TAC nephrotoxicity, which suggests that smoking cessation might be beneficial to transplant smokers taking TAC.
Keyword： Nicotine; Tacrolimus; Oxidative stress; Cell apoptosis;
煙草中尼古丁對(duì)他克莫司誘導(dǎo)腎臟損傷的加重研究
他克莫司(TAC)作為一種非常有效的免疫抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于器官移植、自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、難治性腎病綜合征的治療，盡管發(fā)現(xiàn)了不少新的免疫抑制劑，TAC仍是實(shí)體器官移植免疫抑制方案的基石。然而，長(zhǎng)期使用TAC會(huì)增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)(如腎毒性、神經(jīng)毒性、感染、惡性腫瘤、糖尿病和胃腸道不適)。眾所周知，吸煙是導(dǎo)致各種癌癥、心血管事件(心肌梗死和腦卒中)和阻塞性肺病的危險(xiǎn)因素。吸煙是一項(xiàng)重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，給社會(huì)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，降低生活質(zhì)量。在腎臟方面，吸煙會(huì)加重糖尿病、高血壓、多囊腎和腎移植術(shù)后患者的腎功能不全程度[1]。吸煙還可能導(dǎo)致腎損傷，即使是不存在慢性腎臟病(CKD)的健康人群[2]。尼古丁(NIC) 作為煙草中的天然成分，有成癮性及毒性作用，是對(duì)人體產(chǎn)生有害影響的罪魁禍?zhǔn)字弧Ｎ鼰熓悄I臟疾病的一個(gè)重要且可控制的危險(xiǎn)因素，本研究通過(guò)NIC處理TAC誘導(dǎo)的腎損傷大鼠模型，探討NIC加速其腎毒性的可能機(jī)制。
1、 材料與方法
1.1、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
將32只體重為200～220 g的清潔級(jí)雄性SD大鼠(延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買) ,分別置于恒定溫度、濕度、光照控制的環(huán)境中，并允許自由攝入低鹽飲食(0.05%鹽飼料，低鹽飲食增強(qiáng)TAC腎毒性) 和自來(lái)水。適應(yīng)環(huán)境、低鹽飲食和自由飲水后，體重匹配的大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。①正常對(duì)照組(VH組):皮下注射橄欖油1 ml/(kg·d)。②NIC組：皮下注射橄欖油1 ml/(kg·d)+腹腔注射NIC 1.5 mg/(kg·d)。③TAC組：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg·d)。④TAC+NIC組：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg·d)+ 腹腔注射NIC 1.5 mg/(kg·d)。各組均每日9∶00給藥，共處理4 w后處死大鼠，收集血液、尿液、腎組織標(biāo)本以備進(jìn)一步檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)延邊大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(YBU-2017-045)。
1.2 、生化檢測(cè)
全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(ADVIA 120 ,日本拜耳公司);標(biāo)準(zhǔn)酶比色法測(cè)定血肌酐(Scr) 及血尿素氮(BUN)(Stanbio Lahoratory, Boeme, TX, USA);May-Grun-wald Giemsa 染色法計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞數(shù)，使用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定TAC血藥濃度(TAC con);尿蛋白排泄量測(cè)定采用酶學(xué)比色法(Modular DPP system, Roche)。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清和尿排泄中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG);采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Calbiotech, San Diego, CA) 測(cè)定大鼠血清和尿中的可替寧。
1.3 、腎臟病理
腎臟組織由過(guò)碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(PLP) 固定，過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色，石蠟包埋后4 μm切片，Masson 三色染色，采用彩色圖像自動(dòng)分析儀(Olympus, 日本)高倍鏡視野下分析腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)程度， 每個(gè)標(biāo)本至少觀察 20 個(gè)非重疊腎小管間質(zhì)取平均值。
1.4、 Western印跡法
腎組織標(biāo)本置于管中，加入蛋白質(zhì)緩沖液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH7.6;150 mmol/ml氯化鈉，1%脫氧膽酸鈉，1%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%十二烷基硫酸鈉，1%抑酶肽，2 mmol/L四氧嘧啶，1 ng/ml亮抑酶肽，1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物),室溫勻漿。然后在4℃下，13 000 r/min離心，取上清液，用Bio-Rad蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。取同等量的勻漿在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。在90 V電壓下轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜2 h。浸入5%脫脂奶粉中封閉2 h, 在4℃下分別滴加一抗NADPH氧化酶(NOX)-2(1∶500)、NOX-4(1∶500)、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2(1∶500)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1(1∶500)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)(1∶500)、超氧化物歧化酶(SOD)1(1∶500)、 SOD2(1∶500)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3(1∶500)],一抗與5%脫脂奶粉混合，緩慢搖擺，4℃下過(guò)夜。TBST反復(fù)洗膜3次，加二抗4 h; TBST反復(fù)沖洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，搖床沖洗10 min。使用電化學(xué)增強(qiáng)(ECL)試劑增強(qiáng)發(fā)光，在暗室下膠片曝光，后采集圖像。使用圖像分析儀(Quantity One) 進(jìn)行Western印跡圖像分析。
1.5、 原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)
根據(jù) ApopTag in Situ Apoptosis Detection(Millipore)試劑盒操作步驟測(cè)定細(xì)胞凋亡，200高倍下數(shù)字化顯微鏡分析儀計(jì)數(shù)TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。
1.6 、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA)和 Bonferroni post hoc 校正分析。
2 、結(jié) 果
2.1、 NIC對(duì)基本數(shù)據(jù)及腎功能的影響
與VH組比較，TAC組尿量明顯增加，而NIC+TAC組尿量較TAC組進(jìn)一步增加(P<0.05);TAC組、NIC組尿蛋白、BUN、Scr水平均明顯升高(P<0.05),而NIC+TAC組的尿蛋白、BUN、Scr水平較TAC組進(jìn)一步升高(P<0.05),提示NIC加重TAC誘導(dǎo)的腎功能不全。給藥4 w后，血中TAC濃度增加，而NIC則不影響血TAC濃度。
2.2、 NIC對(duì)TAC誘導(dǎo)的腎纖維化及腎小球硬化的影響
TAC組與NIC組腎組織TIF程度明顯增加，NIC+TAC組腎組織TIF程度較TAC組明顯增加，見(jiàn)圖1。Western印跡法結(jié)果顯示，與VH組[(107.50±15.26)%]相比，TAC組[(192.90±17.14)%]與NIC組[(189.50±12.58)%]腎組織中TGF-β1表達(dá)量明顯增加，NIC+TAC組[(253.20±22.56)%]腎組織中TGF-β1表達(dá)量較TAC組明顯增加(P<0.05),提示NIC增強(qiáng)了TAC誘導(dǎo)的促纖維化TGF-β1過(guò)表達(dá)。
與VH組[(1.34±0.58)%]相比，TAC組與NIC組腎組織PAS染色系膜面積[(16.23±1.99、14.48±1.56)%]明顯增加， 而NIC+TAC組的腎組織中PAS染色系膜面積[(22.24±2.17)%]較TAC組明顯增加(均P<0.05)。
2.3、 NIC對(duì)TAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響
與VH組比較，TAC組與NIC組血清及尿排泄8-OhdG含量均明顯增多(均P<0.05),NIC+TAC組血清及尿排泄8-OHdG含量較TAC組明顯增多(P<0.05),見(jiàn)表2。
表2 各組血及尿中8-OHdG水平的比較(x??±s,n=8,ng/ml)
表2 各組血及尿中8-OHdG水平的比較(x??±s,n=8,ng/ml)
與VH組相比，TAC組與NIC組腎組織中SOD1、SOD2表達(dá)降低，NIC+TAC組腎組織中SOD1、SOD2的表達(dá)較TAC組明顯降低。見(jiàn)表3、圖4。TAC組與NIC組腎組織中NOX-2、NOX-4的表達(dá)升高，NIC+TAC組腎組織中NOX-2、NOX-4的表達(dá)較TAC組明顯升高。見(jiàn)表3、圖5。上述分析顯示，NIC上調(diào)了TAC誘導(dǎo)的NOX2和NOX4的表達(dá)，而抑制了SOD1和SOD2的表達(dá)，說(shuō)明在本模型中NIC和TAC對(duì)氧化應(yīng)激有協(xié)同作用。
表3 各組腎組織SOD1、SOD2、NOX-2、NOX-4、Bcl-2/Bax、Cleaved caspase-3的Western印跡表達(dá)量(x??±s,n=8,%)
表3 各組腎組織SOD1、SOD2、NOX-2、NOX-4、Bcl-2/Bax、Cleaved caspase-3的Western印跡表達(dá)量(x??±s,n=8,%)
2.4、 NIC對(duì)TAC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響
大多數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞或凋亡小體定位于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，尤其是萎縮的腎小管和典型的TIF區(qū)域。與VH組(0.8±0.1)mm2比較，TAC組與NIC組腎組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量[(9.6±0.8)、(3.8±0.2)]mm2明顯增加，NIC + TAC組腎組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(13.9±0.4)mm2較TAC組明顯增加。見(jiàn)圖6。Western印跡結(jié)果示，與VH組比較，NIC組與TAC組腎組織中Bcl-2/Bax比值降低，NIC+TAC組腎組織中Bcl-2/Bax比值較TAC組明顯降低。TAC組與NIC組腎組織中活化的Caspase-3升高，NIC + TAC組腎組織中活化的Caspase-3較TAC組明顯升高。見(jiàn)表3、圖7。
3 、討 論
無(wú)論是健康人群，還是有基礎(chǔ)疾病(如高血壓、糖尿病)的患者，吸煙是一個(gè)可控制的引起CKD進(jìn)展的危險(xiǎn)因素[3]。研究表明，NIC會(huì)增加腎臟的氧化應(yīng)激，從而損害腎小管和內(nèi)皮細(xì)胞的活力和功能，改變腎臟血流動(dòng)力學(xué)，損害整體腎臟功能[4]。此外，NIC增強(qiáng)系膜增生、影響細(xì)胞增殖與凋亡、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)堆積和促進(jìn)腎纖維化途徑來(lái)?yè)p害腎臟功能[2,5,6]。臨床試驗(yàn)表明，吸煙可增加尿白蛋白排泄量，對(duì)腎功能產(chǎn)生不利影響，而戒煙可能改善蛋白尿和腎小球?yàn)V過(guò)率，同時(shí)也可能改善CKD和2型糖尿病患者的蛋白尿，并減緩終末期腎衰竭(ESRD)的進(jìn)展[7,8,9]。此外，無(wú)論是移植物受體還是供體，吸煙都會(huì)導(dǎo)致移植排斥反應(yīng)和慢性移植物腎病(CAN),最終導(dǎo)致腎移植中的移植物丟失[10,11]。提示吸煙可能會(huì)加速接受基于TAC的免疫抑制劑的移植腎功能的喪失。
作為有效且具有良好耐受性的臨床免疫抑制劑，TAC的長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增多、小動(dòng)脈透明質(zhì)酸沉積、腎小管萎縮、腎小球硬化和腎臟間質(zhì)纖維化，最終產(chǎn)生不可逆的腎臟損傷。本文說(shuō)明NIC導(dǎo)致腎臟損傷，與先前研究一致[12]。然而腎毒性模型大鼠用NIC處理后腎功能損傷指標(biāo)進(jìn)一步升高，表明NIC加重TAC誘導(dǎo)的腎損傷。
慢性TAC腎毒性的主要改變?cè)谟谀I小管間質(zhì)區(qū)，如腎小管基底膜增厚、腎小管萎縮和腎小管纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，NIC加重了TAC誘導(dǎo)的部分系膜面積增加和TIF程度。這些病理改變引起更明顯的腎功能損害和尿蛋白排泄的增加。提示吸煙可能加快接受免疫抑制劑治療患者的腎功能損傷。戒煙可能成為延緩或治療腎臟纖維化的重要手段。
慢性TAC腎損傷是多種因素共同導(dǎo)致的結(jié)果，TAC腎損傷與氧化應(yīng)激之間存在密切關(guān)系。氧化應(yīng)激是因?yàn)檠趸€原系統(tǒng)遭到破壞，從而產(chǎn)生大量的活性氧。最近大量研究表明，慢性NIC暴露與腎臟損傷的氧化應(yīng)激之間存在密切關(guān)系[13,14]。氧化應(yīng)激在TIF及腎小球系膜硬化、足細(xì)胞異常和頂葉上皮細(xì)胞損傷的腎小球硬化中起著至關(guān)重要的作用[15]。8-OHdG作為體內(nèi)DNA氧化損傷分泌最終產(chǎn)物的標(biāo)志物，一般蓄積在腎間質(zhì)和腎小管中，且與機(jī)體氧化損傷程度呈正相關(guān)。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化劑，在維持機(jī)體氧化與抗氧化的平衡中起著至關(guān)重要的作用。它能阻斷自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化生成，保護(hù)其不受自由基的損害[16]。近年來(lái)多種不同的腎臟病理模型中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶家族(NOXs) 促進(jìn)腎臟氧化應(yīng)激的發(fā)生。NOX-2和NOX-4是吞噬細(xì)胞中NADPH氧化酶的催化亞基。NOX-2的激活稱為氧化爆發(fā)，促進(jìn)活性氧的生成，導(dǎo)致腎臟損傷。鄭茜子等[17]研究發(fā)現(xiàn)，抑制NADPH氧化酶系統(tǒng)可減輕大鼠腎間質(zhì)纖維化。本研究說(shuō)明NIC增加了氧化蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制了抗氧化蛋白的表達(dá)，從而加重了TAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腎臟纖維化。
細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種獨(dú)特形式。該過(guò)程在發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用。TAC誘導(dǎo)的腎損傷與近端腎小管細(xì)胞凋亡有關(guān)。NIC通過(guò)氧化應(yīng)激或激活TGF-β1誘導(dǎo)足細(xì)胞和腎近端小管細(xì)胞凋亡[18,19]。Bcl-2是抑制凋亡基因。Bax是Bcl-2蛋白家族的一員，當(dāng)Bax與線粒體外膜結(jié)合時(shí)會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑，從而改變其通透性并釋放凋亡蛋白。凋亡Bax和抗凋亡Bcl-2蛋白之間的平衡失衡，在啟動(dòng)凋亡途徑的過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[20]。Caspase-3是凋亡細(xì)胞死亡的執(zhí)行者，其激活被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的一種承諾[21]。細(xì)胞和組織中Caspase-3活性檢測(cè)是多種凋亡信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要方法。上述研究表明，TAC和NIC均誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而NIC能夠加重TAC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟損傷。
綜上，NIC在TAC慢性腎毒性大鼠模型中加重了TAC誘導(dǎo)的腎損傷。氧化應(yīng)激的加重和程序性細(xì)胞死亡可能是NIC有害作用的一個(gè)潛在機(jī)制。
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文章名稱：煙草中尼古丁加重他克莫司腎損傷的研究
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