摘 要：目的：探討環狀RNA(circRNA)＿0031269在宮頸癌組織及宮頸癌細胞中的表達水平。方法：選取2017年1月至2019年12月深圳市前海蛇口自貿區醫院婦科收治的40例宮頸癌切除術后患者的腫瘤組織標本及相應的癌旁組織標本為研究對象。采用實時熒光定量（RT-qPCR）檢測circRNA＿0031269在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達水平，以及在宮頸癌細胞Siha及Hela中的表達水平。結果：circRNA＿0031269在宮頸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織（P<0.05）;circRNA＿0031269在宮頸癌細胞Siha及Hela中的表達水平明顯高于人永生化表皮細胞HaCaT(P<0.05)。結論：circRNA＿0031269在宮頸癌組織和宮頸癌細胞（Siha、Hela）中的表達水平明顯升高。
關鍵詞: circRNA_ 0031269; 宮頸癌; Siha細胞; Hela細胞;
宮頸癌是最常見的婦科腫瘤之一，嚴重威脅女性健康。近年來，雖然宮頸癌的診斷和治療技術取得了很大的進步，但宮頸癌的發病率及死亡率仍很高，特別是對于晚期宮頸癌患者，目前所有的治療方法效果均欠佳[1]。因此，研究宮頸癌細胞增殖、遷移侵襲的機制并尋找新的治療靶點，對提高臨床診斷及治療具有十分重要的意義。環狀RNA(circular RNA,circ RNA）是一種具有共價閉環結構的小分子非編碼RNA，廣泛分布于細胞內。近10年來，已有大量的研究結果證實，circ RNA在腫瘤發生、發展的過程中具有重要的生物學作用[2]。然而，circ RNA調控宮頸癌發生發展的具體分子機制尚未完全闡明。本研究通過檢測circ RNA＿0031269在宮頸癌組織及宮頸癌細胞中的表達情況，探討其在宮頸癌發生發展中的作用，現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2017年1月至2019年12月深圳市前海蛇口自貿區醫院婦科收治的40例宮頸癌切除術后患者的腫瘤組織標本及相應的癌旁組織標本為研究對象。本研究經深圳市前海蛇口自貿區醫院倫理委員會審核，并且批準實施，所有病歷資料征得患者同意，并已簽署知情同意書。
納入標準：(1)經病理組織學確診為宮頸癌。(2)所有宮頸癌患者均無放療或化療、免疫治療等抗腫瘤治療史。(3)術后隨訪資料完整。
排除標準：(1)存在其他婦科疾病。(2)術前進行過放療或服用過抗腫瘤藥。(3)兼具其他臟器的腫瘤患者。
1.2 主要試劑和儀器
宮頸癌細胞系（Siha、Hela）和人永生化表皮細胞Ha Ca T購自美國ATCC（馬納薩斯，美國）；TRIzol試劑購自Invitrogen公司（美國）；反轉錄、實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒購自Ta Ka Ra公司（日本）；RPMI 1640培養基、DMEM培養基、FBS試劑購自Gibco公司（美國）；Nano Drop ND-2000分光光度計購自Life Technologies公司（美國）；Light-Cycler-480 RT-PCR儀購自Roche公司（瑞士）。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養及傳代
宮頸癌細胞Siha、Hela均使用含10%FBS的DMEM培養基培養，所有細胞均在37℃、5%CO2的培養箱環境中培養。當培養皿中細胞生長密度為70%～80%時，即對細胞傳代。
1.3.2 總RNA提取和RT-q PCR
按照說明書，使用TRIzol試劑從組織及對數生長的細胞系中分別提取總RNA；利用分光光度計測量提取的組織及細胞的RNA純度；將純度合格的總RNA 500 ng進行反轉錄，并合成最后體積為10μL的c DNA。應用的反轉錄體系為：2μL 5×Buffer,0.5μL RT Enzyme MixⅠ，0.5μL Oligo d T引物、隨機引物（100μmol/L），總RNA 500 ng，去離子水加至10μL。反應條件為：37℃，15 min,85℃5 s,4℃，+∞。應用的PCR反應條件：95℃30 s后，95℃5 s和60℃20 s，進行40個循環。引物序列見表1。所得數據通過公式2-ΔΔCt進行計算分析，內參采用GAPDH進行標準量化。
表1 引物序列
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以表示，采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
應用實時熒光定量（RT-q PCR）技術檢測circ RNA＿0031269在40例宮頸癌組織與癌旁組織，宮頸癌細胞Siha、Hela與人永生化表皮細胞Ha Ca T中的表達情況，結果表明，circ RNA＿0031269在宮頸癌組織中的表達量明顯高于癌旁組織（P<0.05），見圖1;circ RNA＿0031269在宮頸癌細胞Hela、Siha中的表達量明顯高于人永生化表皮細胞Ha Ca T(P<0.05），見圖2。
圖1?circ RNA＿0031269在癌旁組織及宮頸癌組織中的相對表達量
注：1)P<0.05。
圖2?circ RNA＿0031269在Ha Ca T、Hela、Siha細胞中的相對表達量
注：1)P<0.05。
3 討論
circ RNA與micro RNA、lnc RNA同屬于非編碼RNA，與micro RNA、lnc RNA不同，circ RNA穩定存在于真核生物細胞中，具有多種生物學作用，包括調控基因轉錄、micro RNA海綿吸附作用，甚至有翻譯蛋白質功能[3]。目前，研究發現，circ RNA對包括宮頸癌在內的多種腫瘤的增殖、侵襲和轉移具有重要作用[4]。
circ RNA在許多類型的癌癥中高表達，如乳腺癌、肺癌和大腸癌[5,6,7]。幾種circ RNA在子宮頸癌組織以及衍生的細胞系中異常表達，并且主要通過吸附micro RNA來促進腫瘤發生。有研究報道，由Clorf116基因編碼的hsa＿circ＿0141539(circ RNA-000284）被發現在子宮頸癌組織中的表達明顯高于鄰近的非腫瘤組織，并且與腫瘤的大小、FIGO分期以及子宮肌層浸潤直接相關[8,9,10]。hsa＿circ＿0141539能夠使mi R-518d-5p/519-5p海綿化，從而導致靶基因CBX8的表達增加，并促進子宮頸細胞的惡性轉化。此外，hsa＿circ＿0023404和VEGFA在宮頸腫瘤中被一致上調，而mi R-5047表達不足。
circ RNA＿0031269位于chr14:23495059-23504429，其基因長度為9 370個堿基。目前，尚無關于circ RNA＿0031269與宮頸癌關系的報道。本研究明確了circ RNA＿0031269在宮頸癌組織中的表達量明顯高于癌旁組織（P<0.05),circ RNA＿0031269在宮頸癌細胞Siha、Hela中的表達量明顯高于人永生化表皮細胞Ha Ca T(P<0.05）。
目前，我們對circ RNA調控宮頸癌發生發展的作用機制的了解仍然很有限。現階段大部分研究主要局限于circ RNA的micro RNA海綿吸附作用及其對下游靶基因的調節作用。對于circ RNA的其他功能，如circ RNA與RNA結合蛋白（RBP）的相互作用、circ RNA的蛋白質翻譯功能、circ RNA的功能組學等方面研究較少，這些研究可為探索circ RNA調控腫瘤生物學功能提供更多思路，本研究仍需進一步探索circ RNA＿0031269影響腫瘤發生發展的機制，隨著研究的不斷深入，circ RNA＿0031269調控宮頸癌發生發展的分子機制將會被闡明。
參考文獻
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文章名稱：circRNA＿0031269在宮頸癌組織及宮頸癌細胞中的表達水平
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